乳酸菌活的非可培养态的研究进展

生物饲料工程研究中心 2018-10-02 09:00:13


导读

细菌“ 活的非可培养态(Viable but non-culturable,VBNC)”的概念首次被徐怀恕等提出。细菌的VBNC态指细菌在不良环境条件下会进入异常的生理状态,这种状态下细菌仍有代谢活性,采用常规平板计数方法培养时不能生长繁殖,但当给予适当条件时能复苏并恢复至可培养状态。这一概念在微生物领域一提出就受到了极大的关注,目前已经报道了34个属68 种细菌存在VBNC态,大部分为革兰氏阴性致病菌,对革兰氏阳性菌的研究并不多见。乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)作为一种革兰氏阳性菌,现代分子生物学技术证实某些革兰氏阳性乳酸菌也存在着VBNC态。深入研究乳酸菌的VBNC态,找出适合VBNC 态乳酸菌的复苏方法,为乳酸菌在工业化生产、贮藏和应用过程中保持高活性的状态提供思路和方法。

1乳酸菌VBNC 态概述

乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不产生芽孢、发酵糖类物质产生以乳酸为主要代谢产物的细菌总称。乳酸菌种类繁多,分布也极其广泛,人和动物的肠道、湖泊、污泥等中都存在乳酸菌,目前已发现乳酸菌包括43 个属,373 个种和亚种,而且每年都有新的乳酸菌种属被分离和发现(http://www. bacteria.cict.fr/)。乳酸菌根据形态可分为杆菌和球菌。乳酸菌根据生化特性要分为乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属、肠球菌属、片球菌属、链球菌属和双歧杆菌属等,每个属又包括很多种。乳酸菌已被广泛应用于食品和发酵、饲料、医疗、生物防治等方面。乳酸菌在生产和应用过程一旦受到外界环境压力或营养条件的剧烈改变,就会发生一些变化,乳酸菌会激活多种应激反应去应对不利生存的条件,部分活性乳酸菌会进入VBNC 态或直接进入死亡状态。由于VBNC态的乳酸菌不能通过平板计数的方法检测活菌数,这样就影响到了乳酸菌制品活性的质量评估。VBNC态的乳酸菌可以在一定时间内保持活性,当恶劣环境解除时,又会回到可培养状态。为了提高乳酸菌活性研发先进的检测方法,同时探究乳酸菌VBNC态适宜的复苏条件,使VBNC态乳酸菌重新回到可培养状态,对提高乳酸菌发酵剂的质量,增加乳酸菌制品的高活性状态,降低生产成本等具有重要作用。目前报道了几株乳酸菌存在着VBNC态,见表1。


2乳酸菌VBNC态的诱导

许多环境压力或营养条件的剧烈改变都可以诱导出细菌的VBNC态,如温度、pH值、营养条件、紫外线强度、干燥条件、溶氧量、湿度等。在实验室条件下诱导乳酸菌的VBNC态时,常常采用多个条件复合诱导。


2.1 温度

大量资料显示温度是诱导细菌进入VBNC态的最重要的因子。对乳酸菌VBNC态诱导成功的例子大都采用了低温。魏忠彬证实室温达不到诱导效果,由于室温接近于乳杆菌的最适生长温度37 ℃,对乳杆菌进入VBNC态影响不显著。金磊报道室温诱导的植物乳杆菌很难进入VBNC态,因为室温下的植物乳杆菌生理活性较强,会消耗营养而大量繁殖。李影诱导VBNC 态乳杆菌时,发现室温难以使液体MRS(pH2.0~3.0)中乳杆菌进入VBNC态,而4 ℃可以使其进入VBNC态。许婷将液体LB(pH=7.0)中的双歧杆菌B1 置于4 ℃厌氧条件下,15 天B1 成功进入了VBNC态。值得注意的是,大多数温度的诱导都会伴随着其他因素的共同作用,例如寡营养条件和低酸条件等。


2.2 pH值

诱导细菌进入VBNC态过程中pH值也起到了重要的作用,由于乳酸菌耐酸,所以采用了低酸条件诱导。李影、魏忠彬都用pH值为2.0~3.0 的液体MRS使乳杆菌成功进入VBNC态,同时证实了pH 值为10.0的液体MRS不能诱导出乳杆菌的VBNC态。金磊采用pH值为5.5~6.2 的液体MRS成功诱导了植物乳杆菌的VBNC态。对低pH值的耐受性正是乳酸菌的生理特性之一,环境中的pH值低于细胞正常生理pH 值范围时,乳酸菌能够通过某些机制维持细胞内的pH值高于环境中的pH值,使其保持在正常的生理pH值范围内。


2.3 营养成分

营养成分是乳酸菌生长必不可少的条件,当其所处营养环境发生改变时,乳酸菌自身代谢也会随之改变。Heim 在应用蛋白质组学研究粪肠球菌VBNC态时发现,在碳源耗尽的寡营养条件下,粪肠球菌会对饥饿条件作出应激反应,使其细胞分裂受限制但仍还保持可培养性。Ganesan发现缺乏碳水化合物的乳酸乳球菌会进入VBNC态。细菌适应营养不足条件时的防御措施是减少电子供体的产生、降低有氧呼吸细胞器水平和活性。Pfeffer、Signoretto、Lleo 等对粪肠球菌的诱导也都是采用寡营养条件才得到了VBNC 态的。Wong 等研究发现向乳链球菌的饥饿培养基中添加营养时,反而使它们的可培养能力加速下降。


2.4 时间

细菌进入VBNC态的时间需要十几天甚至几个月的时间,VBNC态维持时间的长短也是不同的。Lleo将湖水过滤灭菌制成寡营养环境,在4 ℃下直接光照培养30 d后,粪肠球菌就进入了VBNC状态。Pfeffer等将粪肠球菌JM83 在人工海水中进行低温诱导,6 d就可以使JM83 进入VBNC 状态。Signoretto 等用4 ℃生井水培养粪肠球菌,在16~20 d后便获得了粪肠球菌的VBNC态。李影报道从雏鸡肠道分离的乳杆菌R1 在4 ℃液体MRS(pH值2.0~3.0)中厌氧培养时,R1 在第41 天进入VBNC态,并在此状态下保持24 d;同样条件处理沈阳辉山乳业有限公司的乳杆菌R2时,其第35 天进入VBNC态,此状态持续时间较长;从猪肠道中分离的乳杆菌R3 会在第46 天进入VBNC态,并维持此状态10 天。许婷对中国工业微生物菌种保藏中心的双歧杆菌B1诱导时,在液体LB(pH值=7.0)中4 ℃厌氧培养的B1 在15 天就进入VBNC态,并且B1在VBNC态维持160天后进入死亡。

3乳酸菌VBNC态的生理生化特性

3.1 形态

       细菌为了应对某些恶劣环境细胞内部会发生变化,并且在外形上会有所体现。目前报道VBNC态细菌形态变化包括细胞体积的缩小,DNA压缩,由杆状变为球体或者菌体的轻微拉长等。金磊等采用扫描电镜观察植物乳杆菌的VBNC 态体积变小,菌体密集,细胞还保持完整的结构。本人采用低温灭菌生理盐水诱导L.caseiZhang VBNC态后,通过扫描电镜观察到VBNC态的L. casei Zhang 长度变短,细胞表面皱缩,但细胞结构依旧完整。然而,并不是所有进入VBNC态的菌体长度都会变短,许婷采用荧光显微镜检测VBNC态的双歧杆菌B1 时发现,细胞会变细拉长,而且内部会有分节段现象,随着时间延长,还会变成链杆状、球杆状、短杆状,而VBNC态结束进入死亡状态后又会变成杆状。Signoretto 等在研究肠球菌VBNC态时就发现,VBNC态的肠球菌细胞会有些轻微的伸长。有趣的是,VBNC态细菌在适宜的条件下复苏后乳酸菌细胞形态又趋向于正常态。金磊采用扫描电镜观察复苏后VBNC态的植物乳杆菌恢复成长杆状,与正常态植物乳杆菌形态几乎无差别,复苏后的细胞大小也与正常状态的细胞相同,并且细胞结构保持完整。


3.2 代谢活性

VBNC态细菌的代谢活性是可以被检测的,进入VBNC态后细菌会发生许多新陈代谢的变化,包括营养物质运输的减少、大分子合成的减少以及呼吸速率降低等。Xie 等发现当Lac.lactisIL1403 在缺乏碳水化合物时,为了继续维持细胞的新陈代谢和能量的供应,菌体自身会调节代谢途径而适应这种环境,在这种条件下的Lac.lactisIL1403 可以维持新陈代谢活性长达2 周。Lahtinen 报道在双歧杆菌B.longum 46、B.longum 2C 和B.animalissubsp. lactis Bb-12 发酵产物的贮藏期间,双歧杆菌会逐渐丧失可培养性而进入VBNC态,同时胞内大分子的合成量和呼吸率也随之降低,但胞内的ATP 和膜电位会仍然保持较高的水平。Ganesan 发现Lac.lactisML3,Lac.lactis IL1403 和Lac.cremorisSK11 在缺少碳水化合物的条件下会进入VBNC态,在此状态下细胞可以保持完整的细胞膜和代谢活性超过3.5 年,也证明了VBNC 态细菌的生存所需的能源和代谢产物主要通过支链氨基酸的分解供给。


3.3 基因表达

细菌VBNC态和正常状态相比,细菌的DNA的复制和基因表达也会发生改变,这种改变主要集中在细胞分裂和代谢方面。Ganesan 等发现Lac. lactisML3,Lac.lactis IL1403 和Lac. cremoris SK11 的VBNC 态细胞,与正常的L.lactis 细胞相比,负责糖代谢和细胞分裂的基因表达被抑制,而负责菌体溶解和细胞壁代谢的基因表达会加强。目前认为细菌DNA不与细胞活性有直接的关系,而mRNA则可以作为检测细胞活性一个合适的标记,所以通过定量分析VBNC态细胞中mRNA含量来检测细胞的活性。Del MarLle 运用RT-PCR 技术检测到VBNC 态的E. faecalis中PBP5(一种青霉素结合蛋白,参与肽聚糖生物合成的终极阶段)基因表达会持续,验证了E. faecalis在滤菌海水环境中的存活能力,他发现VBNC态的E. faecalis可以持续表达PBP5基因至少三个月。

4细菌VBNC态的检测方法

4.1 活菌直接计数法

       活菌直接计数法(direct viable count,DVC)是由Kogure 等提出,又由姚斐等改进的一种检测细菌活性的方法。DVC的原理是:向细菌培养液中添加萘啶酮酸(一种DNA多聚酶的抑制剂),细胞培养后用戊二醛或甲醛固定,经吖啶橙染色后用落射荧光显微镜进行观察,若观察结果显示细胞变粗且伸长则说明其为存活状态。VBNC态的细胞可以在含有萘啶酮酸的培养液中生长,但由于DNA的合成受到了抑制,细胞不能分裂,所以DVC法可以在显微镜下能检测出有代谢活性的细菌数。该方法存在的缺点是多数革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌对萘啶酮酸会产生抗性,为了解决这一问题,有研究者改用环丙沙星来代替萘啶酮酸,也同样起到了抑制DNA的合成作用,并得到良好的效果。


4.2 吖啶橙染色法

人们广泛应用的是吖啶橙染色法(AODC 法)。吖啶橙是经典的极灵敏的荧光染料,会与RNA或单螺旋DNA结合产生橙黄色荧光,与双螺旋DNA结合产生绿色荧光。通常认为活细菌RNA 含量多于DNA 而显示橙黄色荧光,稳定期细胞、饥饿细胞和VBNC细胞RNA含量较少而显示绿色荧光。李影在诱导乳杆菌VBNC 态时,同时采用AODC法进行直接计数和平板计数,分别测定了总菌数和可培养菌数。


4.3 细胞完整性检测法

LIVE/DEADbaclight 试剂盒常用于检测细菌的VBNC 态,该方法是基于细胞质膜完整性的检测方法。试剂盒包含两种核酸染料,分别是SYTO9(绿色荧光染料)和PI(红色荧光染料),其中SYTO9 是一种能穿透完整细胞膜的小分子,PI 是一种可以渗透到细胞膜破损细胞内的大分子。细胞染色后荧光显微镜下观察,有完整质膜结构的细胞呈绿色,细胞膜结构被损坏的细胞呈红色。由于此方法操作简单方便、节省时间,且颜色对比鲜明,所以被广泛于检测细菌的死活状态。许婷应用了此试剂盒检测双歧杆菌VBNC 态,不但确定了其活性,还确知了菌体形态,更利于确定双歧杆菌的VBNC 态。LIVE/DEAD baclight 试剂盒还常常与流式细胞仪、荧光计结合使用。


4.4 流式细胞仪检测法

流式细胞仪检测的原理是:在短时间内可以检测一大部分细菌,并根据不同的细胞参数联系到细胞的各种特征。大多数的荧光探针可以检测活细胞的物理参数,如:细胞膜完整性、胞内酶的活性、细胞质的pH值、膜电势等,这些参数可以用来确定细胞是否有活性。李影采用流式细胞仪与LIVE/DEAD baclight试剂盒结合的方法对乳杆菌VBNC态进行了检测,结果可以明显发现细胞的形态变化,同时根据细菌浓度的比较确定了进入VBNC态的时间。

5乳酸菌VBNC态的复苏

通常认为消除诱导因素便可使细菌VBNC态复苏,如增加营养物质、改变环境温度、取消光照条件等。但由于菌种不同,甚至同种细菌品系的不同,复苏方法也有差异,某些复苏还很难实现。


5.1 改变温度

魏忠彬等对低温诱导出的乳杆菌进行复苏时,采用热激(瞬间升温)、逐步升温和恒温震荡培养都没有成功。而田聪等在诱导大肠杆菌O157:H7 复苏时,采用37 ℃恒温震荡培养的方法,却使O157:H7 恢复到可培养状态。由于复苏机理的研究还很少,方法不够成熟,且革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间存在差别才导致这种结果,所以乳酸菌VBNC态温度的复苏还有待进一步的研究。


5.2 添加营养物质

在复苏时,添加一定的营养物质可以使其恢复到可培养状态。Sirnoretto 等将VBNC态粪肠球菌的菌液加到胰蛋白胨大豆肉汤培养液(TSB)中37 ℃培养3天后便复苏了粪肠球菌;Pfeffer 等将VBNC态粪肠球菌菌液加入到5 mL的TSB 后,再将其稀释至5%于37 ℃恒温振荡培养后,也使VBNC态粪肠球菌复苏成功。


5.3 添加有机物质法

添加某些有机物质,可以在刺激乳酸菌生长的同时,还可以降解代谢产生的副产物,从而促进细胞恢复活性。李影在复苏VBNC态乳杆菌时,取500 uL VBNC菌液加入到5 mL 液体基础培养基中,然后再按7%~10%比例分别加入维生素C、维生素B2、过氧化氢酶、Tween-20、Tween-80、无菌血液等,同时调pH 值至7.2~7.6,然后在37 ℃ 恒温振荡培养箱中培养48 h,结果显示只有加Tween-80 的培养基能复苏乳酸杆菌。魏忠彬等在研究VBNC乳杆菌的复苏时发现,加6%的Tween-20可以使乳酸杆菌复苏。

6结束语

越来越多的细菌被发现有VBNC 态。由于VBNC态的细菌用常规的方法检测不到,容易在实际检测中造成漏检。尤其是VBNC态的致病菌仍然会有致病性和抗原性,如果遇到适宜条件它们会复苏而继续繁殖,对食品安全和人类健康带来了很大的威胁。随着人们对VBNC态细菌研究领域的不断扩大,许多乳酸菌也渐渐被证实存在着VBNC态。VBNC态的存在会使活菌制剂产品中活菌数的评价将不能完全依赖于平板计数,因为一旦乳酸菌进入VBNC态,平板读数显然会低于活菌数量,造成检测结果的偏差。虽然VBNC态的存在,会对乳酸菌的工业化生产带来影响。因为不需要提供必需营养和生存条件就可以长期保持活菌数,所以VBNC态也可以解决目前乳酸菌存在的某些难题,如延长菌种保存期、维持活菌数量、保持菌种活力等。而综合目前研究来看,人们对乳酸菌VBNC态的研究还很少,尤其是对其复苏、诱导和检测方法还需进一步完善。对VBNC态乳酸菌进行更深入的研究,可以为今后乳酸菌在工业生产、贮藏和应用过程中保持高活性状态提供新思路和新方法。

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责编:马维军;审阅:陈达;

(来源:中国乳品工业;作者:王亚利 包秋华 王俊国 张和平


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