优良动物源抗汞益生乳酸菌的筛选及其抗性基因的最新研究进展

仰韶生化 2018-09-02 08:48:25


笔者从健康狐狸和貉子粪便中筛选出耐酸、耐胰酶、耐胆汁、抗菌并具有较高汞抗性的乳酸茵,采用16S rRNA基因序列分析鉴定,并用PCR方法扩增merA基因,从72株优良益生菌中逐级筛选出耐酸、耐胰酶、耐胆盐、抗茵性能好并能耐受500 mg/L HgCl2的高浓度重金属汞的一株细菌,命名为CJT-KHgl,测定了其益生特性指标。结果表明:经过16S rRNA序列分析,该茵株为乳酸片球菌;该菌株的merA基因序列与克雷伯氏茵、阴沟肠杆菌、希瓦氏菌merA基因序列的同源性达到99%,证明为乳酸片球菌;从该菌株中克隆到的汞抗性基因为汞还原酶基因(Mercury reductase)


1、抗汞细菌的筛选及结果

无菌挑取1 g左右粪便样品,加入9 mL生理盐水中溶解,倍比稀释1×1031×1041×105倍悬液,各取100μL涂布于含300 mg/L HgC12MRS培养基平板,置于37℃恒温培养24 h,共获得具有耐汞能力的菌株72株,其中49株呈过氧化氢阴性,仅有22株为革兰氏阳性菌。将耐汞菌株在相同汞浓度的培养基上进行分离、纯化,将纯化后的菌株保存菌种。最后将22株分离菌接种于含有350400500 mg/L Hg2+MRS固体培养基,筛选出9株耐受汞的浓度可达500 mg/L并且性能良好的菌株。将分离株进行多次传代培养,分离菌株的耐汞性仍表现稳定,未发生显著变化。

2、抗汞细菌的益生特性测定结果。见表1、表2

3、16S rRNA测序结果

16S rRNA基因序列经BLAST序列比对,结果表明,菌株CJT-KHglPediococcus acidilactici的基因序列相似度达到99%;分离菌CJT-KHgl 16S rRNA基因序列的进化树也显示,基因序列与Pediococcus acidilactici的多种种属菌高度同源,可以确定该菌株为乳酸片球菌。

4merA基因的PCR扩增结果

根据文献设计引物,成功扩增到merA基因全长为1 686 bp的序列。通过测序的基因序列在BLAST进行对比,发现该序列与克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、希瓦氏菌的merA基因序列同源性达到99%。因此,该菌株为乳酸片球菌。本试验从乳酸片球菌属所克隆得到的merA基因与克雷伯氏菌属以及其他细菌中的merA基因高度同源可能是自然界merA基因自发水平转移的结果。见图3

笔者通过动物源样本的菌株筛选及鉴定得到了具有高抗汞性细菌,经16s RNA基因序列经BLAST序列比对,与Pediococcus acidilactici的基因序列相似度达到99%,分离菌CJT-KHgl 16S rRNA基因序列的进化树也显示,基因序列与Pediococcus acidilactici的多种种属菌高度同源,可以确定该菌株为乳酸片球菌。该菌是一株生物安全菌株,其在重金属汞机体中毒方面具有很好的应用潜力,并为将来构建宽宿主范围的抗重金属益生菌提供理论基础和试验材料。

参考文献

[1]陈金泰,谷姗姗等. 优良动物源抗汞益生乳酸菌的筛选及其抗性基因的克隆[J].黑龙江畜牧兽医,2017(02上):138-141.

[2] NASCIM ENTO A MCHARTONESOUZA EOperon Merbacterial

resistance to mercury and potential for bioremediation of contaminated environments[J]Genet Mol Res20032(1)92-101


5、乳酸菌对小鼠粪便主要菌群的影响

5.1 乳酸菌数量变化

    乳酸菌为人和动物肠道最重要的益生菌之一,人们最早对益生菌的认识源于乳酸菌。研究结果表明,辛伐他汀处理试验期小鼠粪便乳酸菌数量呈下降趋势,由4.5×107CFU/g 降为3.7×106CFU/g,而乳酸菌处理明显升高,由6.6×107CFU/g升高到9.5×108CFU/g。同一处理试验开始与试验结束小鼠粪便乳酸菌含量表现为:生理盐水处理无显著差异,辛伐他汀试验结束比试验开始显著降低,乳酸菌处理试验结束比试验开始显著提高。不同处理间小鼠粪便乳酸菌数量,复合乳酸菌处理最高,其次是生理盐水,辛伐他汀处理最低,处理间差异均达到显著水平(表4)。说明他汀类药物对小鼠肠道有益菌产生不良影响,而乳酸菌处理通过增加肠道有益菌数量而改善了肠道微生物菌群。

5.2 双歧杆菌数量变化

    双歧杆菌为大肠内最重要的益生菌,对机体抗衰老和抗癌症等均具有重要作用。研究结果表明,试验开始和试验结束生理盐水和复合乳酸菌处理粪便双歧杆菌数量无显著差异,辛伐他汀处理试验结束粪便中双歧杆菌数量显著降低,而且与另外两个处理的降低的差异亦有显著性意义(表4

5.3 大肠杆菌数量

大肠杆菌为主要肠道菌群,也是一类重要的潜在有害菌。试验结果表明,小鼠粪便大肠杆菌数量试验结束与试验开始比较,生理盐水组和辛伐他汀处理也略有降低,复合乳酸菌处理显著下降,由1.02 × 107CFU/g 粪便下降为4.0 ×104CFU/g。不同处理间比较分析,乳酸菌处理显著低于生理盐水和辛伐他汀药物(表4)。说明乳酸菌处理显著降低了肠道有害菌大肠杆菌的数量。


6、结论

笔者本试验利用高脂血症小鼠模型,研究了乳酸菌制剂和降血脂药物对血清总胆固醇、甘油三酯等指标的影响。结果表明,乳酸菌处理和辛伐他汀药物显著降低了血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平。乳酸菌和药物处理间差异不显著,说明服用乳酸菌能达到与药物相同的降血脂效果(见表2)。肠道微生物与脂肪代谢密切相关,乳酸菌处理小鼠粪便乳酸菌数量比辛伐他汀药物处理显著升高,对小鼠血脂降低起到重要作用。乳酸菌及菌体代谢物有抗胆固醇因子,乳酸菌的代谢能显著减少肠管对胆固醇的吸收,同时,乳酸菌吸收部分胆固醇并将其转变为胆酸盐从体内排出。

参考文献

[1]王武华,王翠萍等.乳酸菌对高血脂症小鼠血脂和肠道菌的影响[J].中国康复医学杂志,2017,39(9):989-993.

[2] Karlsson FH, Tremaroli V, Nookaew I, et al. Gut metagenome in European women with normal, impaired and diabetic glucose control[J]. Nature, 2013, 498 (7452):99-103.

[3] Viaud S, Saccheri F, Mignot G, et al. The intestinal microbiota modulates the anticancer immune effects of  cyclophosphamide[J]. Science, 2013, 342 (6161) : 971-976.(转自“沃看畜牧”)