李彤乳酸菌发酵对复合豆乳饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响

食品与发酵工业杂志 2019-08-17 14:42:27

乳酸菌发酵对复合豆乳饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响

李彤,彭珍,熊涛*

(南昌大学 食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌,330047)

  以植物乳杆菌发酵复合豆乳饮料为研究对象,对复合豆乳发酵前后的蛋白质、小肽、脂肪、乳酸及氨基酸含量进行测定。采用高效液相色谱法测定发酵前后大豆异黄酮单体含量;采用顶空固相微萃取结合气相色谱/质谱联用技术分析鉴定复合豆乳发酵前后香气成分;通过3种体外总抗氧化能力测定方法对复合豆乳发酵前后抗氧化能力进行分析和评价。结果表明,复合豆乳发酵后小肽、乳酸、氨基酸含量较发酵前显著上升(p<0.05);糖苷型异黄酮转化为游离型异黄酮;总抗氧化能力较发酵前有所增加;醇、酸、酯类等香气成分在发酵后显著增加,有利于改善复合豆乳风味。

关键词 植物乳杆菌;发酵复合豆乳饮料;风味物质,大豆异黄酮;抗氧化活性

发酵复合豆乳是将豆类磨浆后接种乳酸菌,经发酵而赋予豆浆特殊风味的产品,不仅可以弥补大众植物性乳源的不足,而且产品本身营养丰富,蛋白质含量高,易于消化吸收,能调节肠胃功能,克服乳糖不耐症,是一种很有发展前景的发酵制品。研究发现,乳酸菌在发酵复合豆乳时产生的胞外多糖对铅等重金属有很好的吸附作用[1];发酵复合豆乳中的乳酸菌具有抗肿瘤、抗氧化、防衰老、增强免疫力的作用[2-5];另外,乳酸菌产生的醇、酸等挥发性风味物质能够改善复合豆乳的风味,同时可利用豆类中存在的棉籽糖等低聚糖进行发酵产酸,避免其被肠道微生物分解代谢产生CO2、H2等气体而引起胀气[6]。乳酸菌发酵复合豆乳不仅包含了豆类的营养功能,还包含了乳酸菌的保健功能,可促进人体健康。但目前市场上乳酸菌发酵复合豆乳饮料种类较少,相关研究也不多。韩剑骄[7]等在红豆乳中加入赤藓糖醇进行乳酸菌发酵,开发出风味独特的无糖发酵红豆乳饮料。李程程[8]等选用一种能够产黏性物质的乳酸菌对大豆乳进行发酵,开发出高黏度酸豆乳。曹婷[9]将黑豆乳与鲜牛乳混合进行乳酸菌发酵。以上研究多集中在工艺方面,且多针对单一种类豆乳进行发酵,选用的菌种多集中于传统的酸奶发酵菌种,如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等,而针对植物乳杆菌单菌发酵复合豆乳饮料的成分及功能性的研究较为少见。

本文采用植物乳杆菌发酵复合豆乳,分析了复合豆乳发酵前后营养成分、大豆异黄酮及体外抗氧化活性的变化,同时对复合豆乳发酵前后香气成分的变化进行分析,为进一步优化发酵复合豆乳生产工艺及功能性提供技术参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌菌剂(NCU1124),由南昌大学食品科学与技术国家重点试验室保藏提供;黄豆、花生、红豆、绿豆,福建辉业食品有限公司;白砂糖,太古糖业中国有限公司;果葡糖浆,均为食品级。

磺基水杨酸、正己烷、无水乙醇、三氯乙酸、CuSO4,K2SO4均为国产分析纯;甲醇、乙腈均为色谱纯;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、大豆苷标品、大豆苷元标品、染料木苷标品、染料木素标品、抗坏血酸标准品,美国Sigma公司;ABTS试剂盒、FRAP试剂盒,碧云天生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

JYL-C16V九阳料理机,九阳股份有限公司;DNP-9272型电热恒温培养箱,上海精宏试验设备有限公司;Agilent 7890 /7000A 三重串联四级杆气质联用仪,安捷伦科技有限公司;手动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB /CAR/PDMS57328-U萃取头,美国Supelco公司;LXJ-IIB型低速大容量多管离心机,上海安亭科学仪器厂;DNP-9272型电热恒温培养箱,上海精宏试验设备有限公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色谱,安捷伦科技有限公司;Varioskan LUX多功能微孔板读数仪,赛默飞世尔科技有限公司;JMS-50J胶体磨,廊坊通用机械制造有限公司;FiveEasy Plus FE28数显pH测定仪,梅特勒-托利多国际股份有限公司;YXQ-LS-50/75SII型立式压力蒸汽灭菌锅,上海博迅实业有限公司医疗设厂;PB 203-N分析天平,上海世义精密仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵豆乳工艺流程

四种原料(黄豆、花生、绿豆、红豆) →烘烤→浸泡→热烫→去皮→磨浆→蒸煮→过滤→混合→调配→灭菌→冷却→发酵→后熟→发酵复合豆乳半成品

(1)烘烤:烘烤温度120 ℃,时间1 min;(2)浸泡:0.5% NaHCO3浸泡12 h;(3)热烫:热烫温度90 ℃,时间8 min;(4)磨浆:固液比1∶8(g∶mL),热水磨浆;(5)混合:4种原料配比黄豆∶花生∶红豆∶绿豆为35%∶35%∶15%∶15%;(6)调配:加入果葡糖浆;(7)灭菌:温度102 ℃,时间15 min;(8)发酵:最佳发酵工艺由单因素及正交试验确定。

1.3.2 乳酸菌发酵复合豆乳饮料发酵工艺的确定

1.3.2.1 单因素试验

参考文献[10-13]并加以改进。以活菌数及感官评价为指标,研究乳酸菌发酵复合豆乳时的接种量、果葡糖浆添加量、发酵温度及发酵时间4个因素对发酵效果的影响。

1.3.2.2 正交试验

在单因素试验的基础上进行正交试验,以感官评分和活菌数为指标确定最佳发酵工艺条件,正交试验因素表见表1。


表1 正交试验因素表
Table 1 Factors and levels for L9(34) orthogonalarray design


1.3.3 测定方法

酸度测定[14]:标准碱滴定法(以乳酸计);pH值测定:FE28型pH计;活菌数测定[15]:GB法;感官评定参照文献评定[12];蛋白质、小肽测定[16]:凯氏定氮法;脂肪的测定[17]:盖勃法;氨基酸含量测定[18]:茚三酮比色法;大豆异黄酮的测定[19-20]:高效液相色谱法。每个样品重复测定3次。

1.3.4 香气成分测定[21]

取5 mL样液置于15 mL顶空瓶中,加入2 g NaCl,于45 ℃水浴条件下平衡10 min,插入老化后的纤维头,在45 ℃下顶空萃取40 min,迅速拔出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口中,热解析5 min。

色谱条件:色谱柱:HP-5;升温程序:40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃,再以10 ℃/min升至210 ℃,保持1 min;载气(He)流速0.8 mL/min,进样口温度:250 ℃,分流比:5∶1。

质谱条件:电子轰击离子源,电子能量70 eV;离子源温度200 ℃;检测电压350 V;质量范围m/z 33~450 amu。

1.3.5 抗氧化能力的测定

1.3.5.1 ABTS法测定抗氧化能力

参照ABTS试剂盒使用说明,使用酶标仪对每个样品重复测定3次。

1.3.5.2 FRAP法测定抗氧化能力

参照ABTS试剂盒使用说明,使用酶标仪对每个样品重复测定3次。

1.3.5.3 DPPH·清除能力[22-23]

标准曲线:分别吸取2、3、4、5、6 mL质量浓度为0.145 mg/mL的VE溶液,再加入3.9 mL 2.9 mmol/L的DPPH溶液,混匀,避光放置30 min,用无水乙醇作参比,在波长517 nm处测定吸光度A,然后测定3.9 mL 2.9 mmol/L的DPPH溶液与0.1 mL无水乙醇混合后的吸光度A0。以VE溶液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,建立回归方程:y=-0.571x+1.36,R2=0.997。

样品测定:取2 mL样液,10 000 r/min离心10 min,吸取上清液0.3 mL,后续步骤同上。同时以0.11 mg/mL的VC溶液做抗氧化阳性对照。样液自由基清除能力表示为1 mL样品中VE当量,每个样品重复3次。

1.4 数据处理

所有实验均重复3次,采用系统统计软件SPSS 22.0进行显著性分析,p<0.05认为差异显著,采用Origin9.0作图。

2 结果与分析

2.1 发酵复合豆乳饮料工艺条件的确定

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 果葡糖浆添加量对复合豆乳发酵的影响

经过处理后的复合豆乳会损失较多碳源,因此需要添加碳源以促进乳酸菌生长[24]。果葡糖浆中的葡萄糖作为单糖利于乳酸菌的利用,果糖则可以适当中和发酵酸味,使糖酸比较为适宜,风味更佳。由图1可知,随着果葡糖浆添加量的增加,pH先上升后略有下降,酸度先下降后略有上升,感官评分呈先上升后下降趋势,在添加量为10%时评分有最高值。糖浆添加过少,乳酸菌生长不足,产酸过少,风味不足;添加量过多,酸甜比失调,口感甜腻。与不加糖浆相比,添加糖浆后活菌数均显著增加但随添加量变化不大。

图1 果葡糖浆添加量对发酵复合豆乳的影响
Fig.1 Effect of syrup content on fermented compound soymilk

2.1.1.2 接种量对复合豆乳发酵的影响

由图2可以看出,随着接种量增加,酸度逐渐上升,与未接种相比,接种后pH迅速下降,但受接种量变化的影响较小,可能是由于复合豆乳体系pH达到等电点凝乳后pH变化较小,感官评分和活菌数均先上升后下降,分别在0.03%和0.04%时有最大值,但此时活菌数差别不大,故最佳接种量选择0.03%。

图2 接种量对发酵复合豆乳的影响
Fig.2 Effect of inoculation on fermented compound soymilk

2.1.1.3 发酵温度对复合豆乳发酵的影响

发酵温度过低或过高均不利于乳酸菌发酵。由图3知,随着温度升高,酸度迅速升高,pH逐渐下降。感官评分和活菌数分别在37 ℃和32 ℃时有达到峰值,但由于在这两个温度时活菌数相差不大,故选择37 ℃为最佳发酵温度。

图3 发酵温度对发酵复合豆乳的影响
Fig.3 Effect of temperature on fermented compound soymilk

2.1.1.4 发酵时间对复合豆乳发酵的影响

发酵时间是复合豆乳发酵过程中重要影响因素之一。发酵时间过短则不凝乳,复合豆乳涩味重,风味不足。发酵时间过长会导致产酸过多,口感刺激,乳清析出,质地下降。如图4所示,随着发酵时间的增加,乳酸不断积累,酸度迅速上升,后期渐缓,pH反之。活菌数和感官评分均先上升后下降,且二者均在30 h时有最大值,故最佳发酵时间选择30 h。

图4 发酵时间对发酵复合豆乳的影响
Fig.4 Effect of time on fermented compound soymilk

2.1.2 正交试验

试验结果如表2所示,由极差分析可知,影响发酵复合豆乳感官评价的主次因素依次为果葡糖浆添加量、发酵时间、发酵温度、接种量,最佳优化组合为A3B1C2D2。影响活菌数的主次因素依次为发酵温度、接种量、发酵时间、果葡糖浆添加量,最佳优化组合为A3B3C2D2。验证试验如表3所示,两组合在菌落数上差异不显著,最终选择感官评分较高的A3B1C2D2为最优组合,即果葡糖浆添加量12%、接种量0.02%、发酵温度37 ℃、发酵时间30 h。


表2 正交试验结果
Table 2 L9(34) orthogonal array design and results



表3 验证试验结果
Table 3 Results of verification experiment


2.2 复合豆乳发酵前后营养成分的变化

大豆、花生、绿豆、红豆的主要成分为蛋白质,因此复合豆乳中的蛋白质含量是一项重要的指标;小肽是一种具有多种特殊理化性质和生物活性的物质,可以被人体快速、直接的吸收。有研究表明,豆乳经植物乳杆菌发酵后,其中饱和脂肪酸所占脂肪酸比重升高,有利于降低豆腥味,提高香气成分含量[25];乳酸是发酵主要代谢产物,具有抑制肠道杂菌生长繁殖、调节正常菌群的功能[26]。由表4可知,复合豆乳发酵后,总蛋白含量变化不显著,略微的增加可能是引入了菌体蛋白;植物乳杆菌在发酵过程中将部分蛋白质降解为小分子肽的形式,与发酵前相比小肽含量显著上升(p<0.05),增加了33%;脂肪含量相比发酵前降低了6%,经软件分析差异显著(p<0.05);未发酵复合豆乳中含有少量乳酸,经发酵后含量显著上升。


表4 复合豆乳发酵前后成分变化
Table 4 Changes of components of compound soybeanmilk before and after fermentation


注:表中数值为平均值±标准偏差(n=3)。各行不同字母间差异显著(p<0.05)。

发酵复合豆乳中共检测出14种游离氨基酸,其中必需氨基酸7种。氨基酸变化如表5所示,植物乳杆菌发酵过程中产生蛋白酶,将蛋白质降解,游离氨基酸总量显著增加,与发酵前相比增加了21.2%。赖氨酸含量在发酵后降低较大,降低了42%;蛋氨酸发酵前后无明显变化,除此之外,其他氨基酸在发酵后含量均有所增加。必须氨基酸含量的增加对人体的营养补充尤为有益,其中增加较多的必须氨基酸为苯丙氨酸、缬氨酸,分别增加了62.5%和50%。非必须氨基酸中酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸含量增加较多,均增加了28.5%。


表5 复合豆乳发酵前后游离氨基酸变化
Table 5 Changes of amino acid of compound soybean milkbefore and after fermentation


注:表中*表示必须氨基酸。

大豆异黄酮是存在于豆科植物中的一类生物类黄酮物质,它具有预防骨质疏松症、癌症、心血管疾病及改善妇女更年期综合征等生理功能,而游离型大豆异黄酮比糖苷型大豆异黄酮更具生物活性[27]。大豆异黄酮变化如图5所示。

图5 复合豆乳发酵前后大豆异黄酮变化
Fig.5 Changes of isoflavone of compound soybean milk before and after fermentation

发酵可以明显改变复合豆乳中异黄酮的组分,但对异黄酮总量影响不大。发酵后糖苷型异黄酮的含量显著降低,游离型异黄酮的含量显著升高,大豆苷元和染料木素分别提高了2.9倍和6.4倍,而总含量变化不显著(p>0.05)。说明发酵可使糖苷型异黄酮转化为游离型异黄酮,大大提高了饮料的保健功能。

2.3 复合豆乳发酵前后香气成分的变化

采用气相色谱和质谱联用的方法,对复合豆乳发酵前后风味物质进行分析比较,结果如表6所示。发酵前后风味物质有明显变化,发酵前共检测出29种物质,主要由醛、醇、酯、酮、酸、呋喃和少量烯烃类化合物构成,其中醛类10种,醇类5种,酯类4种,酮类3种,酸类2种,呋喃类1种。主要香气成分为醛类,其次是醇类,分别占总量的78.94%、6.8%,其中含量较高的是正己醛、1-辛烯-3-醇。发酵后共检测出35种物质,复合豆乳发酵前后在风味构成成分、数量和比例上差异较大,醇、酸、酯类化合物含量及种类明显增加,醛类明显减少,酮类含量减少但种类发生改变,呋喃类无明显变化;醇类占总量比例最大为74.28%,其次是醛类,占9.45%。其中正己醛在醛类所占比例较大,其具有草腥味,被认为是产生豆腥味的主要原因;1-辛烯-3-醇具有蘑菇味,也是产生豆腥味的物质之一,二者在发酵后含量均显著降低,极大程度上改善了发酵复合豆乳饮料的风味。反式-2-壬烯醛、癸醛分别具有黄瓜香、柑橘香,发酵前检出含量较少而发酵后含量增加,说明发酵增加了复合豆乳本身香气。新增风味物质中1-壬醇具有强烈的玫瑰香气和橙花香气,癸基氯乙酸酯具有果香清甜气,月桂醛呈皂香、蜡香和紫罗兰花香[28-29],这些香气成分进一步丰富了发酵复合豆乳饮料的风味。

2.4 总抗氧化能力的测定

2.4.1 ABTS+自由基清除能力

以Trolox溶液浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,建立回归方程为y=0.217x+0.654,R2=0.992 2。样品的ABTS+自由基清除能力以TEAC值,即Trolox的当量表示。以0.11 mg/mL的VC溶液作抗氧化阳性对照。由表7可知,复合豆乳发酵前后对ABTS+自由基的清除能力均较高,发酵后抗氧化能力显著增加(p<0.05),说明发酵复合豆乳饮料对ABTS+自由基有很强的清除能力。

2.4.2 FRAP还原能力测定


表6 复合豆乳饮料发酵前后挥发性成分变化
Table 6 Volatile components of fermented compound soybean milk

注:-表示未检出。

表7 ABTS的抗氧化能力

Table 7 Antioxidant capacity of ABTS


注:表中数值为平均值±标准偏差(n=3)。各行不同字母间差异显著(p<0.05)。

以FeSO4溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,得到线性回归方程y=0.355x+0.043,R2=0.995 7。样品的总抗氧化能力以FeSO4标准溶液的浓度表示。由表8可知,复合豆乳经发酵后其FRAP还原能力显著增加(p<0.05),说明发酵提高了复合豆乳饮料的抗氧化能力。


表8 FRAP的总抗氧化能力
Table 8 Antioxidant capacity of FRAP


注:表中数值为平均值±标准偏差(n=3)。各行不同字母间差异显著(p<0.05)。

2.4.3 DPPH·清除能力测定

本实验中样品的DPPH·清除能力以VE当量表示,如表9所示,复合豆乳经发酵后VE当量由0.72 mg/mL降低到0.55 mg/mL。对比阳性对照组可知,虽然复合豆乳经植物乳杆菌发酵后其DPPH·清除能力降低,但仍保持较高的抗氧化能力。

表9 DPPH·清除能力

Table 9 DPPH scavenging ability


注:表中数值为平均值±标准偏差(n=3)。各行不同字母间差异显著(p<0.05)。

3 结论

本研究选取植物乳杆菌NCU1124发酵复合豆乳饮料,探究了其发酵工艺,并从营养成分、香气成分、体外抗氧化能力方面比较了发酵前后的变化。结果表明,果葡糖浆添加量为12%,接种量0.02%,37 ℃发酵30 h后的复合豆乳饮料,口感最佳,活菌数较高,小肽含量、酸度显著增加,氨基酸总量提高了21%,糖苷型大豆异黄酮单体减少,游离型大豆异黄酮单体显著增加;通过GC-MS分析复合豆乳香气成分,发酵前后分别测定出29、35种挥发性成分,发酵后醇、酸、酯类化合物含量及种类增加,以醇类为主,占74.28%,醛类减少,产生豆腥味的物质减少,新产生了芳香成分;体外抗氧化试验表明,复合豆乳发酵后对FRAP还原能力、ABTS+清除能力升高,对DPPH·清除力略有下降,但仍能保持较高的抗氧化能力。

通过研究可以看出,植物乳杆菌发酵可改善复合豆乳饮料的营养成分,提高营养价值,丰富其香气成分,且发酵前后均具有较强的抗氧化能力,具有一定的开发价值。同时本研究发现,游离异黄酮单体的增加可能会影响抗氧化能力,在后续工作中可进一步对异黄酮与抗氧化能力间的相关性进行研究。另外发酵复合豆乳的活性成分结构及作用机理仍需进一步探究。

第一作者:硕士研究生(熊涛教授为通讯作者,E-mail:xiongtao0907@163.com)。

基金项目:国家重点研发计划(2017YFD0400503);江西省蔬菜产业技术体系岗位专家项目(JXARS-06)

收稿日期:2017-10-25;改回日期:2017-11-25

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.016105

引用格式李彤,彭珍,熊涛.乳酸菌发酵对复合豆乳饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响[J].食品与发酵工业,2018,44(4):111-118.

LI Tong, PENG Zhen, XIONG Tao.Effects of lactic acid bacteria on nutritional components, aroma components and antioxidant activity of compound soybean milk[J].Food and Fermentation Industries,2018,44(4):111-118.