三代测序技术助力乳酸菌资源的开发与利用

益生之源 2018-08-31 08:50:34

PacBio RS II是2013年4月由Pacific Biosciences公司推出基于单分子实时测序技术 (Single Molecular Real Time Sequencing, SMRT) 的三代测序仪。其工作原理是结合了聚合酶的环状DNA文库进入到零波导纳米孔中,四种携带荧光信号的碱基也进入纳米孔中,当碱基和DNA文库配对复制时,会被酶固定一段时间,这个时候发出的荧光信号会停留一段时间,由camera拍摄下来形成movie文件,实现单分子实时测序。PacBio RS II测序平台较二代测序的几大优点:

 1、超长的测序读长:平均测序读长能达到15000碱基,最长的序列能达到20000碱基以上;

 2、极端的准确率:对基因组组装和基因组变异检测,最高可达到99.999%的准确率;选用环形测序模式,测序准确率可以在达到单个分子99%准确率的条件下,读长超过经典的Sanger测序法;

 3、极度的敏感性:可以检测频率在0.1%的 minor variants;

 4、直接检测广泛的碱基修饰:除了5-methylcytosine修饰以外, 还可以检测N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化损伤以及其它碱基的修饰;

                        

 5、最小的GC偏向性(GC bias):在极端高GC和极端低GC区域,可以轻松测定,从而保证序列的均匀覆盖度;

 6、无PCR扩增偏向性:样本不需要进行PCR扩增,避免了覆盖度不均一和PCR artifacts。

 

    内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室于2014年11月引进了三代测序平台,该平台除了PacBio RS II测序仪,还配备GX脉冲电泳、Blue pippin片段筛选仪、ProFlex PCR 系统和Corais M220等满足三代测序所需的一系列仪器设备,可保证测序平台的高效率运转。到2017年5月22日为止,共运行了133个Run,完成约4000份样品的测序,包括:奶粉、酸马奶、奶酪、泡菜等食品和人、奶牛、犬、小鼠等肠道菌群以及其他环境样品和乳酸菌菌株的测序。测序项目的开展是围绕食品微生物和肠道菌群进行的,以乳酸菌特别是自主研发的益生菌为中心展开相关实验,两年内基于此平台见刊的SCI论文14篇 (见表1),正在投稿的有5篇。



    首次将三代测序技术应用于婴儿配方奶粉细菌污染的评估中,打破了配方奶粉中不存在微生物污染的认识。婴儿配方奶粉由于原料营养丰富、生产工艺要求特殊,原奶中微生物、储藏和加工过程中发生的污染、增殖等均影响到婴儿奶粉的质量与安全。且灭活微生物产生的耐热脂肪酶和蛋白酶经过高温灭菌后仍有残留,也可导致乳粉溶解度降低、产生异味、品质

表1见刊SCI论文信息

变。利用三代测序技术,不需要纯培养可以快速准确地检测出曾经存活和依然存活在配方奶粉中的微生物。研究结果发现,极低含量的致病菌曾经出现在原料乳或原料乳的处理过程中,在随后的加热工艺中被灭活,但是这些污染微生物短期的存在也有可能增加产品腐败的风险。婴儿配方乳粉过嗜冷芽孢杆菌和嗜热芽孢杆菌的存在, 以及Bacillus cereusAnoxybacillus flavithermus的出现,可能影响产品的货架期。同时,对国内外奶粉中微生物组成的差异进行了比较,发现,国产婴儿配方乳粉中乳酸乳球菌、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和明串珠菌(Leuconostoc lactis)的含量显著高于进口婴儿奶粉,而嗜热


图1 婴儿配方奶粉中细菌和蛋白氮相关性(左)和不同奶粉样品中内毒素的比较(右)

 

脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus) 和Anoxybacillus flavithermus在进口奶粉中显著高于其在国产婴儿奶粉中的含量。这项研究为配方奶粉微生物安全监测提供了新的思路(图2)。

    另外,三代测序技术在不同类型发酵食品微生物多样性的研究方面也显示出了卓越的优势。通过三代平台,第一次成功解析了锡盟酸马奶、四川泡菜、不同地区的奶酪、清酒等传统发酵食品中的微生物结构。在酸马奶中,瑞士乳杆菌、乳酸乳球菌副乳链球菌 和 Rothia nasimurium是优势菌种,同时还发现在酸马奶发酵后期Enterococcus的一些种的相对含量会增加。四川泡菜中Lactobacillus acetotoleransLactobacillus brevis是含量最丰富的细菌,且它们的含量都和泡菜的酸度呈正相关,同时还发现随着泡菜的酸度增加,细菌多样性降低,其中包括乳杆菌和条件致病菌都在减少 (图2)。

 

    图2 不同酸度的泡菜中优势菌种的相对含量

 

    三代测序技术可以测定细菌16S rRNA基因序列全长,因此在肠道菌群的研究中也发挥了重要的作用。利用三代测序技术,我团队研究了短时间内主食的改变对蒙古人肠道菌群的影响,结果发现,主食改变会降低蒙古人肠道菌群的多样性,且一些和碳水化合物代谢相关的细菌(多边型拟杆菌和白色瘤胃球菌显著增高, 脆弱拟杆菌和凸腹真杆菌显著降低)也发生着变化,这些菌种的增高和降低与主食类型呈对应关系,进一步表明主食改变影响着人体肠道菌群。张勇等人将Lactobacillus casei Zhang和维生素K2干预患结肠癌的小鼠模型,基于三代测序发现Helicobacter apodemusHelicobacter mesocricetorumAllobaculum stercoricanisAdlercreutzia equolifaciens 的含量显著降低(图3),同时研究显示Lactobacillus casei Zhang是通过增加CLCN3的表达来降低NF-κB等炎症信号分子来预防结肠癌。基于益生菌的研究,以及基于动物模型和人体的肠道菌群相关性研究,使人们对益生菌和肠道菌群交互作用有了进一步的认识。

图3 Lactobacillus casei Zhang和维生素K2干预

           后结肠癌小鼠肠道菌群的变化

     

    另外,三代测序技术在测定乳酸菌等微生物全基因组时,其长读长的优势使得组装更加快速准确,能够用1个cell轻松完成一个细菌基因组图谱。在测定全基因组序列的同时,还可以捕获甲基化位点。我们团队利用三代测序, 测定L.caise zhang和L. plantarum P-8全基因租的时候发现L.caise zhang 存在6mA这个甲基化修饰。

 

    多年来内蒙古农业大学乳品生物技术与工程实验室以分离不同环境中乳酸菌为研究基础,致力于筛选优质的食品发酵剂和优良益生菌菌株的同时,专注于自主研发的益生菌与机体的互作,以及对机体肠道菌群的影响等的研究。三代测序技术的引进,给我们的研究引入了一个全新而高效的手段,为后期对乳酸菌研究的突破和优良发酵剂的筛选奠定扎实的基础,并在探寻自主研发的益生菌的益生功效的研究中起到积极的作用。

     此外,三代测序技术在微生物多样性研究、基因组学、宏基因组学、转录组学等方面的应用日益广泛,作为一种基因测序手段,需要不断设计和试验,改进分析流程,实现最佳的测序效果,才可以充分发挥其优势,进而助力我们深入解析乳酸菌的奥秘,同时通过测序和其它研究手段相结合的方式,将为相关研究提供新的思路和方法。