猪源乳酸菌的筛选、体外益生效果评价及对小鼠肠道菌群的影响

中国畜牧杂志 2018-04-15 15:59:38
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抗生素的使用在促进畜牧养殖业发展、保证动物健康和提高养殖效益等方面发挥了重要作用。但长期使用抗生素会破坏机体所拥有的正常微生物屏障,造成正常微生物菌群的生态平衡破坏,加快细菌的耐药性进化等问题。目前,欧盟、韩国等国家已全面禁止饲用抗生素的使用。美国、日本等国家也对饲用抗生素的使用做出了严格的限制,并积极寻找可替代抗生素的产品。我国也颁布了相关规定限制饲用抗生素的使用。

益生菌制剂是当前重点研究的抗生素替代品之一,益生菌的作用主要包括改善营养物质在动物体内的吸收和利用、调节动物的新陈代谢水平、促进肠道发育、维护肠道正常菌群平衡、提高机体免疫力等方面。其中,乳酸菌是益生菌中最为重要的一个类群。目前,研究着重从菌株对病原菌的抗性、耐酸、耐胆盐等胃肠道耐受性角度开展益生乳酸菌的效果评价,但益生菌对肠道黏附特性及针对动物体内的研究评价相对较少。本试验拟从健康仔猪粪便中分离出具有优良体外益生作用的乳酸菌菌株,并探讨其对小鼠肠道内菌群的影响,从而为进一步研制乳酸菌类益生菌提供试验基础。

1材料与方法

1.1 菌株和培养基   

   菌株分离样品采集于萧山永王牧业公司健康仔猪的新鲜便。

    MRS液体培养基:略。LB液体培养基:略。指示菌:略。

1.2 乳酸菌的分离和筛选  

称取1 g新鲜的粪便,加入到10 mL无菌生理盐水中,涡旋2 min,10倍梯度稀释后,采用含有1%碳酸钙的MRS固体培养基混平板,放入小型厌氧罐中于37℃恒温倒置培养36 h,从中挑取具有较大溶钙环,且镜检无芽孢的菌落进行划线分离。划线分离的单株菌落接种于100 mL MRS液体培养基中富集24 h,取菌液进行革兰氏染色,并采用MRS斜面4℃保藏,并进行后续益生特性复筛。

1.3 乳酸菌体外益生特性分析

(1)乳酸菌的抗病原菌特性

乳酸菌的抑菌活性采用牛津杯法测定。


(2)乳酸菌的耐酸特性

将乳酸菌液体按照1.0×108的接种量,接入到pH为5.0、4.0、3.0和2.0的MRS液体培养基中,于37℃恒温培养3 h后,取出混平板计数。结果以细菌菌落数的对数值log(CFU/mL)表示。


(3)乳酸菌的耐胆盐特性

  将乳酸菌液体按照1.0×108的接种量,分别接入到终浓度为0.1%、0.2%和0.3%牛胆盐的MRS液体培养基中,37℃恒温培养36 h后,通过混平板计数。结果以细菌菌落数的对数值log(CFU/mL)表示。


(4)乳酸菌的体外黏附特性

      体外黏附试验参照Tham等的方法。黏附率=(与黏蛋白结合的菌数/初始加入菌数)× 100%。

1.4 乳酸菌菌株的鉴定

将目标菌株在MRS平板上划线,37℃培养48 h,观察菌落形态,并挑取单菌落进行显微观察。将益生特性复筛的乳酸菌按3%接种量接入MRS液体培养基中,于37℃静置培养36 h后,取1.5 mL菌液采用DNA提取试剂盒提取细菌的总DNA。随后采用提取的DNA为模板,扩增16S rRNA基因。获得的序列结果提交到GenBank数据库进行Blast搜索,并获取登录号。

1.5 动物评价

6周龄雄性昆明系清洁级小鼠共30只。小鼠随机分为3组,每组10只,1只1笼(n = 10)。对照组小鼠饲喂常规育成辐照饲料和自由饮水;生理盐水组小鼠在对照组基础上,每日灌喂生理盐水0.3 mL;乳酸菌组小鼠在对照组基础上,每日灌喂浓度为108 CFU/mL的乳酸菌0.3 mL。试验期共35 d,包括预试期7 d和正式试验期28 d。

试验正式期结束后,拉颈处死小鼠,在无菌条件下取出小鼠盲肠内容物,测定小鼠盲肠内容物中总活菌数、肠杆菌、乳酸杆菌、总厌氧菌数量,结果以每g内容物中细菌菌落数的对数值log(CFU/g)表示。

2结 果

2.1 乳酸菌分离筛选 

通过对健康仔猪粪便样品进行分离,最终获得6株乳酸菌。它们在MRS平板上的菌落形态均为圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色的小菌落,革兰氏染色阳性,无芽孢、无鞭毛的球菌或杆菌,分别命名为R1~R6进行后续益生效果评价。


2.2 乳酸菌的抑菌能力的测定     

由表1可知,分离到的6株乳酸菌对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和藤黄微球菌等4株指示菌均具有抑制能力,其中菌株R1的抑菌圈直径均高于其他乳酸菌(R2~R6)(P<0.05)。

2.3 对低pH值耐受能力的测定   

表2可知,低的pH环境对6株乳酸菌的生长均有抑制。当pH为3.0和4.0时,菌株R1的菌数均高于其他菌株(P<0.05);在pH值降到2时,6株乳酸菌的活菌数均显著下降(P<0.05)。

2.4 对高胆盐环境耐受力的测定 

由表3可知,在胆盐浓度为0.1%时,菌株R1和R2的菌数显著高于其他菌株(P<0.05);在胆盐浓度为0.2%和0.3%时,菌株R1的数量最高;其中在pH为0.3%时,菌株R1的数量仍超过1.2×107 CFU/mL,表明菌株R1可耐受浓度为0.3%的胆盐。

2.5 对细胞黏附性的评价  

由表4可知,所分离到的6株乳酸菌均可黏附于猪肠道黏膜蛋白。其中,菌株R1的黏附率显著高于其他菌株(P<0.05)。

2.6 乳酸菌株R1的鉴定 

乳酸菌R1菌株在MRS平板上培养 48 h后,形态如图1所示。菌落呈奶白色圆形,边缘整齐、表面湿润光滑、有酸味。挑取单菌落镜检观察,菌体呈短杆状,直径为(1.0~4.0)μm ×(0.4~0.8)μm。


乳酸菌R1的16S rDNA序列测序后,提交到GenBank数据库,获得序列登录号为KM396757。对测得的序列进行同源性对比后表明,菌株R1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)16S rDNA序列的相似性达到了99%,因此R1初步鉴定为植物乳杆菌。

2.7 对小鼠肠道内菌群的定量检测      

由表5可知,与对照组和灌喂生理盐水组相比,灌喂乳酸菌R1组小鼠的肠道内乳酸菌数量显著升高(P<0.05),而肠杆菌数量显著降低(P<0.05)。此外,灌喂乳酸菌对小鼠肠道内总耗氧菌和总厌氧菌的数量无显著影响(P>0.05)。


3讨  论

3.1  乳酸菌体外益生效果评价       

Fuller等认为,寄主和肠道菌群之间存在着特异性相互选择关系,动物肠道内的微生物菌株更易在动物体内繁殖和定植。因而理想的益生菌菌种最好筛选自同源动物的肠道, 以便增强益生菌特异性功效。此外,乳酸菌还可通过产生细菌素和过氧化氢等物质抑制其他有害微生物的生长,从而促进肠道菌群平衡,维护肠道健康。本试验筛选到的乳酸菌对低pH值的耐受情况差异较大,其中在pH为3的条件下,R1的耐受能力显著高于其他菌株,存活率都能达到90%以上。仔猪出生时胃内pH在5~6,随后逐步维持在3左右。因此,筛选的R1菌株能够耐受动物胃内低酸环境。另一方面,十二指肠中的胆汁酸盐对外源细菌具有抑制作用,细菌在肠道的存活和增殖,必须能够耐受0.3%胆盐的环境。


益生菌顺利进入肠道后发挥益生作用的一个重要机制是与病原菌竞争在肠道的结合位点,因此有必要对筛选益生菌的肠道黏附特性进行研究。由于正常菌群的定植往往需要通过多糖和脂蛋白的相互作用实现,因此益生菌黏附能力的高低可能与其脂蛋白组成成分和比例有关,需要进一步研究。

3.2  乳酸菌对小鼠肠道菌群的影响      

乳酸菌R1经鉴定为植物乳酸菌(L. plantarum)。该菌株是常用的制备发酵液体饲料的菌株。本研究进一步通过小鼠动物试验表明,通过每日灌喂植物乳杆菌R1,与对照组相比,可显著提高小鼠肠道内乳酸菌的数量,同时显著降低肠杆菌数量,表明植物乳杆菌R1在小鼠肠道内发挥了益生作用。目前,通过体内试验探讨益生菌作用效果的报道越来越受到学者重视。魏衎等采用肉鸡试验评价了乳酸乳球菌的益生效果,发现其可改善肉鸡的日增重及免疫器官重量。考虑到养猪场的饲养条件和卫生环境差异很大,后续还有必要进一步研究植物乳杆菌R1在猪肠道内的定植情况和体内益生效果,已验证其功能。

4结 论

(1)本试验从仔猪粪便中筛选获得6株乳酸菌,其中植物乳杆菌R1具有最佳的耐受胃肠道环境和黏附能力,且对伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和藤黄微球菌有较强的抑制能力。

(2)小鼠体内试验表明,植物乳杆菌R1可显著提高灌喂小鼠肠道内乳酸菌含量,同时降低肠杆菌数量,表明其具有较大的应用前景。



      注:本文原文刊登在《中国畜牧杂志》2016年19期,作者为孙  宏,卢志超,吴逸飞,王  新,柳  永,姚晓红,汤江武 。此文为摘录部分,如需阅读原文,可与《中国畜牧杂志》编辑部联系(周老师:17703866955)。如需转载,请注明出处。