乳酸杆菌促进肠道干细胞再生!

人体微生态 2018-11-15 15:12:01


导读

肠道隐窝基部的肠道干细胞(ISCs)具有调控肠上皮细胞的增殖和分化的重要作用。虽然对调控ISCs功能的宿主内途径的理解已有进展,但外源因素对ISCs生物学的影响仍然知之甚少。

益生乳酸杆菌是肠道微生物群的重要组成部分。乳酸菌可以增强肠道屏障的完整性并减少疾病表型,如胃肠道感染和IBD。然而,乳酸杆菌对ISCs的影响仍不清楚,可能是因为缺少合适的体外模型。

本研究的目的是探讨Lactobacillus reuteri D8LPLs的刺激作用及其对IL-22分泌和ISCs再生的影响,旨在阐明乳酸杆菌通过促进ISCs发挥对肠上皮的保护作用。



论文ID



原名:Lactobacillus accelerates ISCs regeneration to protect the integrity of intestinal mucosa through activation of STAT3 signaling pathway induced by LPLs secretion of IL-22

译名:乳酸杆菌通过激活LPLs分泌IL-22诱导STAT3信号途径,加速ISC再生以保护肠粘膜的完整性

期刊:cell death and differentiation

IF:8.399

发表时间:2018年

通信作者:Qinghua Yu

通信作者单位:南京农业大学




实验设计




实验内容


1建立肠道类器官和LPL共培养模型

本研究建立了肠类器官和LPL的共培养系统(图1a)。LPL和肠类器官以71的比例培养于Matrigel(人工基底膜)中,可以从细胞培养孔中直接观察肠类器官和LPLs(图1b)。培养第3天,类器官开始出芽(图1c)。

图 1


2、在TNF-α损伤后,D8促进肠类器官的生长和恢复

采用肠道类器官和LPLs的共培养模型检测L.reuteri D8或热灭活D8HK-D8)是否促进TNF-α损伤后的肠类器官生长和恢复。结果发现:与对照组和HK-D8组相比,L. reuteriD8显著增加出芽类器官的表面积和数量(图2a)。鼠源TNF-α(60 ng/mL)导致受损的类器官的数量显着增加(图2b)。然而,L. reuteri D8显着改善了TNF-α引起的肠类器官损伤(图2c)。但是,HK-D8对肠类器官没有保护作用(图2c)。TNF-α引起肠类器官形态学损伤,隐窝只有少量EdU阳性细胞(图2d)。然而,D8显着增加了EdU阳性细胞的数量,进而增加了出芽类器官的表面积和数量。此外,D8TNF-α损伤的隐窝中也可以维持EdU阳性细胞数量,从而加速了恢复过程。但是,HK-D8对上皮细胞增殖没有刺激作用。

图 2


3D8促进肠道生长并改善DSS诱导的小鼠结肠炎

BacLightTMGreen标记的L. reuteri D8灌胃后,在小鼠空肠和结肠定植,为D8与肠上皮的接触提供了机会(图3a)。此外,D8灌胃16小时,乳杆菌浓度达到106CFU/g粪便,表明L. reuteri D8可以定植于肠腔并与肠粘膜接触(图3a)。

对照组和D8处理组小鼠持续增重,而DSS处理组小鼠在DSS处理3天后,体重开始下降。但是,D8显著地缓解了DSS引起的体重减轻(图3b)。与对照组相比,DSS处理显着降低结肠长度,而D8缓解了DSS诱导的结肠长度减少(图3c)。组织病理学切片发现,DSS组小鼠出现明显的肠道水肿和结肠组织黏膜层的致密浸润,以及结肠腔和肌层的病理性出血(图3d)。而D8改善了DSS引起的病理改变,D8+DSS组的结肠结构正常并且没有出血。

D8处理组小鼠的绒毛比对照组小鼠更长、更深。此外,与DSS组相比,D8改善了肠道结构损伤,显著增加了绒毛高度和隐窝深度(图3f)。

DSS处理损伤了空肠和结肠形态,并且增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞的比例显著降低。然而,D8不仅在生理状态下显著促进PCNA阳性肠上皮细胞增殖,并且改善了DSS导致的受损的增殖状态,加速复原过程(图3eg)。此外,与DSS处理组相比,D8+DSS组小鼠的TNF-α和IL-1β的蛋白质水平显着降低(图3h)。

图 3


4D8增加Paneth细胞的数量并在损伤后刺激ISCs再生

ISCs对损伤引起的肠道再生至关重要。Lgr5是一种ISCs标记物,主要在肠隐窝基部标记ISCs。结果发现:与TNF-α组相比,D8显著增加Lgr5阳性细胞的数量(图4a)。此外,Lgr5的蛋白质表达(图4b)和ISC标记物(Lgr5Olfm4Ascl2)的mRNA表达(图4c)进一步验证了D8ISCs的刺激作用。并且,D8增加了Lgr5阳性细胞的数量并改善了DSS引起的空肠Lgr5阳性细胞数量的减少(图4d)。

本研究发现,与对照组相比,TNF-α处理显著减少了溶菌酶阳性细胞的数量以及Paneth细胞标记物(Lyz1Defa6)的mRNA表达水平(图4f)。D8改善了TNF-α引起的类器官中或DSS引起的小鼠中的溶菌酶阳性细胞的减少(图4eg)。

 

图 4


5D8在体外和体内上调IL-22的表达

IL-22促进ISC介导的上皮再生。在本研究中,与LPLs共培养时,与对照组相比,D8显着刺激IL-22的分泌,进而促进乳杆菌对肠上皮细胞的保护作用(图5a)。如果模型中没有LPLD8不能诱导IL-22的分泌(图3c)。有趣的是,TNF-α治疗也增加了IL-22的产生,但是D8通过促进IL-22分泌进一步提高了修复效率(图5a)。此外,添加抗IL-22抑制了D8IL-22对肠类器官生长(包括表面积,出芽和增殖)的刺激作用(图5bc)。加入抗IL-22后,D8TNF-α损伤的肠类器官形态的保护作用也受到抑制(图5d)。结合以上结果,我们发现D8刺激LPL分泌IL-22和肠上皮细胞增殖,从而促进TNF-α引起的损伤的有效恢复。

然而,不同浓度(0.1, 1, 10 mM)的HK-D8和嗜酸乳杆菌ATCC4356以及几种微生物相关分子模式(MAMP),如肽聚糖,磷壁酸,多糖不能显著上调共培养模型中的IL-22表达(图5ef)。不同浓度(0.1 ,1 ,10mM)的乙酸盐,丙酸盐,丁酸盐和乳酸也不能。然而,不同浓度(0.1 ,1 ,10 mM)的吲哚-3-甲醛激活AhR,在共培养模型中上调IL-22的表达(图5g)。此外,AhR抑制剂CH-223191可以抑制D8或吲哚-3-甲醛诱导IL-22分泌的作用(图5h)。因为吲哚-3-甲醛是L. reuteri D8的代谢物,进一步证实了D8通过激活AhR诱导IL-22的表达。DSS处理没有降低IL-22的表达,但是D8DSS处理下进一步增强了IL-22的产生(图5i)。

图 5


6D8通过分泌IL-22激活pSTAT3信号传导途径

D8处理后促进肠类器官出芽,增加pSTAT3阳性细胞(红色荧光显示)。然而,添加抗IL-22抑制了D8对类器官的刺激作用(图6a)。Western印迹进一步验证该结果(图6b),表明D8通过诱导IL-22的分泌导致肠类器官中STAT3的磷酸化。

与对照组相比,D8处理增加抗微生物肽Reg3bReg3g mRNA的相对表达。此外,与TNF-α诱导的类器官损伤相比,D8在病理状态下增强Reg3bReg3g表达(图6c)。此外,小鼠的空肠和结肠中Reg3bReg3g的表达也增加(图6d)。

图 6




实验结论


本研究首次报道了乳杆菌促进肠上皮细胞增殖并缓解TNF-α引起的肠道损伤的机制。此外,本研究证明D8通过激活AhR,进而诱导LPL分泌IL-22,随后激活STAT3的磷酸化以加速ISC再生,并恢复TNF-α损伤的肠上皮结构(图7)。

图 7



点评


与其他干细胞不同,ISCs与肠道微生物群共存,这可能会影响上皮细胞的再生。本研究首次报道了乳杆菌对肠道干细胞再生的影响,对相关领域的研究具有很深的启发价值。


本文由莫孞编译,莫秋芬、江舜尧编辑。