李粟琳可发酵三七等中药材的食用菌种筛选和皂苷生物转化产物的分析

食品与发酵工业杂志 2018-05-15 15:31:37

可发酵三七等中药材的食用菌种筛选和皂苷生物转化产物的分析

李粟琳1,张翔宇1,王洋1,郭宇瑛1,姜国正1,周瑞1,王昱升2,李涛3

1(北京中医药大学 中药学院,北京,100029)2(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214063) 3(中国食品发酵工业研究院,北京,100027)

摘 要 研究了保加利亚乳杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和冠突散囊菌等食品工业中常用的微生物菌种对三七之类的中药原料的生物转化,利用HPLC分析了不同菌种直接发酵对人参皂苷组成的影响。通过不同微生物菌种的发酵,三七、人参和西洋参所含的Rb1、Re等常见人参皂苷会分别转化为Rh1、C-K和Rd等稀有人参皂苷,产物中没有检测到Rh2等人参皂苷,说明菌种产生的糖苷酶具有相当的专一性,为进一步对特殊目标皂苷的开发利用提供了基础。

关键词 三七;皂苷;生物转化

三七是五加科人参属植物三七(Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen)的宿根,是我国名贵中药材,也是云南独具特色的中药材资源,具有止血、活血化瘀等功效。现代药理学研究证明,人参皂苷为三七的主要有效成分之一,具有止血、调血脂、抗血栓、增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化等作用。前人研究发现,三七总皂苷PNS中的人参皂苷Rg1、 Rb1在抗细胞增殖和抗肿瘤等方面均显示出一定的药理作用[1-7]。另有人参稀有皂苷如Rb3、Rh2、Rh3、Rh1、Rg,具有高抗肿瘤作用,但由于含量较低,这种有很高活性的稀有皂苷不易在自然界直接获得[8-9]。因此,开发人参属稀有皂苷具有极高的价值和前景。

国际上有很多的研究者开展了包括利用土壤微生物在内的特定菌种和酶制剂进行皂苷转化的研究,在这些研究中,利用专一性的糖苷酶的水解作用,使得高级皂苷分子上的特殊糖苷键发生选择性的水解,可产生低糖苷取代的稀有的次级皂苷。由于这些研究中多利用提纯后的皂苷和酶制剂进行皂苷生物转化工艺复杂,成本高,同时很多菌种为植物腐败菌,缺乏安全性评价。为了提高诸如饮片之类的中药重要剂型的效力,有必要开发安全可靠的三七发酵炮制工艺。本研究拟利用食品加工中公认安全的食用菌种对三七之类的中药原药在相对特殊的条件下进行直接皂苷生物转化,考察不同发酵过程中皂苷成分的变化情况,以发现更多的可用于皂苷转化的新菌种和转化体系,进而为开发不同功能的临床重要制剂和药膳等方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

原料与试剂:三七,产自云南省文山;西洋参,产自美国威斯康辛州;人参,产自吉林省白山市;人参皂苷标准样品R1、Rg1、Rb1、Re、Rh、C-K、Rd、Rg3,纯度均为98%以上,叶源科技公司产品;无水乙醇,北京化工厂产,分析纯;乙腈,Fisher产品,色谱纯。

菌种:保加利亚乳杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、冠突散囊菌、高温厌氧球菌,由天然食材中分离得到。

表1 实验菌种
Table 1 Experimental stains

1.2 实验方法

1.2.1 微生物转化三七等植物原料的方法

1.2.1.1 发酵培养基的制备

用植物粉碎机将三七、人参、西洋参块根粉碎,过筛,收集粒度为40目以上的粉末。加蒸馏水配置成3 g/L的悬浮液,250 mL三角瓶分装100 mL。在115 ℃下灭菌30 min。

1.2.1.2 菌种的活化和发酵

取各菌种的冷冻甘油管1管,约1 mL,在无菌条件下接种到含质量分数为5%葡萄糖的5 mL YPG培养基中,在37 ℃下活化培养24 h。将活化培养后的液体培养物1 mL接种到YPG培养基中进行二次活化。培养24 h后,接种到发酵培养基中,进行发酵。其中,GS、H-20、P-Lac、B-548、C19-14在51℃静置发酵,霉菌GT在31 ℃下摇瓶发酵。

1.2.2 样品的制备

发酵培养6 d后,进行灭酶处理。后置于-20 ℃冰箱中保存备用。分别取2 mL发酵后的样品加入8 mL无水乙醇超声浸泡1 h。离心取上清液,经0.22 μm膜过滤后即得HPLC分析样品。

1.2.3 采用HPLC法分析发酵对人参皂苷组成的影响

色谱条件:色谱柱:C18柱(250 mm×4.0 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-水(B);流速:0.6 mL/min;梯度: 0~15 min,19%A等度;15~25 min,19%A~29%A线性梯度;25~35 min,29%A~40%A线性梯度;35~55 min,40%A~100%A线性梯度;进样量,10 μL;柱温,35 ℃;检测波长:203 nm。

2 结果

2.1 微生物菌种发酵三七等原料

在本研究中,除了冠突散囊菌为常温条件下的有氧发酵外,其余的菌种都可以在高温下利用三七等底物进行厌氧高温乳酸发酵(50 ℃以上),生长情况以凝结芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌较好,而鼠李糖乳杆菌等较差。GT菌的淀粉水解情况较好,产生的色素较多。其余的菌种在高温发酵下并没有显著的色素产生,发酵6 d后,发酵液中积累的乳酸约为20~ 40 mmol/L。

2.2 人参皂苷的HPLC测定

利用HPLC方法对三七等五加科植物皂苷含量进行测定的方法已有很多,但存在分析时间过长(90 min以上),或者分离度不高的情况。本研究通过对色谱条件的优化实现了在较短时间内利用C18色谱柱的皂苷的高效组分分离和分析。图1是在优化的色谱条件下对皂苷标准品的HPLC分析的色谱图,从分离和分析效果看所选定的分析方法可以满足对三七等植物样品微生物发酵过程的皂苷成分的分析。从色谱图的出峰顺序上看,各种皂苷分子上的糖苷取代程度和位置与保留时间的长短没有明显的对应关系,说明无论是三醇型还是二醇型的人参皂苷的近乎平面构型的苷元部分似乎更能决定其在固定相上的保留行为。

图1 人参皂苷标准品进行分析的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC map of standard ginsenoside samples

2.3 微生物发酵对三七总皂苷组成变化的影响

由于微生物没有合成人参皂苷的能力,所以三七等原料在菌种发酵前后的变化可以反映出培养过程中微生物所产的各种糖苷酶对皂苷上不同的糖苷键的水解程度的差别。从对照组的三七皂苷的HPLC图谱中可见,其中的主要皂苷为R1、Rg1和Rb1等高糖基取代的高级皂苷,而保留时间较长的低糖基取代的次级皂苷含量较少(见图2)。

图2 未经微生物作用的三七总皂苷的HPLC谱图
Fig.2 HPLC map of control Panax notoginsen ginsenoside sample

在筛选菌种的实验中,基本上不转化这些主要皂苷的微生物菌种有Q、B-548等菌种(图3、图4)。

图3 对三七皂苷转化能力较弱的菌种—Q的HPLC谱图
Fig.3 HPLC map of a weak Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-strain Q

图4 对三七皂苷转化能力很弱的菌种B-548的HPLC谱图
Fig.4 HPLC map of a weak Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-strain B-548

其中对三七总皂苷中的Rg1、Rb1和R1转化能力较强的菌种有GS和D-Lac等乳酸菌,主要的产物为Rh1等皂苷物质(图5、图6)。

图5 对三七皂苷有较强转化能力的菌种GS的HPLC谱图
Fig.5 HPLC map of a strong Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-strain GS

图6 对三七皂苷有较强转化能力的菌种D-Lac的HPLC谱图
Fig.6 HPLC map of a strong Panax notoginsen ginsenoside transformation strain-stranin D-Lac

2.4 微生物发酵对西洋参高丽参总皂苷组成变化的影响

通过HPLC分析,西洋参的总皂苷组成以Re和Rb1为主要的皂苷成分(见图7)。

图7 西洋参总皂苷的HPLC谱图
Fig.7 HPLC map of total ginsenosides of the American ginseng

经过微生物发酵,总皂苷会发生一系列变化,如菌种C-19可以将Rb1转化为C-K,它是一种重要的功能性皂苷(见图8)。

图8 经菌种C-19转化后的西洋参皂苷组成的HPLC谱图
Fig.8 HPLC map of total American ginseng ginsenosides after the treatment of strain C-19

冠突散囊菌是一种丝状真菌,该菌种的显著特征是可以将其他的皂苷成分转化为人参皂苷Rd,以及多种未知结构的高保留性的皂苷产物(见图9)。

图9 冠突散囊菌GT转化西洋参的HPLC谱图
Fig.9 HPLC map of total American ginseng ginsenosides after the treatment of strain GT

高丽参的总皂苷组成以Re和Rb1为主要的皂苷成分,可能是因为原料质量的原因,总的皂苷含量偏低,见图10。

图10 高丽参总皂苷的HPLC谱图
Fig.10 HPLC map of total ginsenosides of the American Panax ginseng

经过微生物发酵,仅在冠突散囊菌GT发酵的样品中可见皂苷Rd含量的变化(图11)。

图11 高丽参经冠突散囊菌GT转化后的皂苷组成的HPLC谱图
Fig.11 HPLC map of total Panax ginseng ginsenosides after the treatment of strain GT

3 讨论

五加科植物体内所含的二醇型人参皂苷都具有图11的结构,由于R2为非糖基可取代的H,故只在环上C-3位置的R1和侧链C-20位置的R3的OH上结合了不同的糖(链),产生了多种皂苷系列化合物。

不同的微生物由于所产生的糖苷酶的种类和选择性不同,对R1、R3位置上的取代糖基的水解能力不同,所以其产物皂苷的组成也不同。从我们所做的菌种筛选的结果的发酵前后的总皂苷组成的HPLC分析结果来看,基本可以确定不同菌种的皂苷转化的途径。

图12 二醇型人参皂苷的结构关系
Fig.12 Sructures of PPD-type saponins

在本研究的微生物转化过程中,微生物可以显著地水解高级皂苷上的不同的糖苷键,使次级皂苷如Rd、C-K和Rg3等功能性皂苷的量增加,但没有检测到Rh2等皂苷,说明这些微生物水解β-(1-2)糖苷键的能力较低而水解β-(1-6)糖苷键的能力较强。

对三七中含量较高的三醇型人参皂苷,如Re和Rg1等,某些乳酸菌可以在高温下将其侧链C-20上的葡萄糖苷键水解掉,得到Rh1等次级皂苷,其可能的转化途径见图13。

图13 三醇型人参皂苷的转化途径
Fig.13 Transformation pathway of PPT-type saponins

微生物发酵转化五加科皂苷的研究目前已经比较广泛了,本研究利用食用微生物菌种,在较高的转化温度下直接对植物的药用部分进行发酵转化,具有比采用常温发酵微生物更高的转化便利性和可操作性,从测试的菌种中找到可以将Rb1等常见人参皂苷转化为功能性更强的Rd、C-K和Rh1等稀有皂苷的候选菌种,为今后进一步进行转化菌种的选育和转化条件的优化创造了条件。

我国是三七等五加科药用植物生产和应用的大国。如三七在云南省的栽培生产量非常巨大,由于没有新的合适的转化和深加工技术,原药的供应远超实际需求,近年来的售价出现连续暴跌,严重损害了产业的发展。随着国内对五加科植物在食品和餐饮行业应用限制的放开,市场上对于功效更强的人参产品的需求也更加迫切,利用食用菌对原料进行深度加工具有广阔的应用前景,尤其是在药膳和酵素用途的和稀有人参皂苷的大批量生产上。

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Screening of edible fungi for fermentation of Panaxnotoginseng Chinese medicinal herbs and analysis ofbiotransformation products of saponins

LI Su-lin1,ZHANG Xiang-yu1,WANG Yang1,GUO Yu-ying1,JAING Guo-zheng1,ZHOU Rui1,WANG Yu-sheng2,LI Tao3

1(Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,100029) 2(School of Biotechnology,Jiangsu University,Wuxi 214122,China) 3(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

ABSTRACT The cultivation and application of the medicinal plants of Panax ginseng in China,including Panaxnotoginseng has a long history and it is of great significance to the development of these precious resources by fermentation.In this paper,we studied the fermentation processes of these raw materials with microbial strains belong to Lactobacillus bulgaricus,Bacillus coagulans,Lactobacillus rhamnosus and Eurotium cristatum etc.which commonly used in food industry.HPLC was used to analyze the changes of ginsenoside compositon after different fermentaion.Through the fermentation with different microbial strains,Rb1,Re and other common ginsenoside which contained in Panax notoginseng,ginseng and American ginseng were biotransformed respectively into Rh1,C-K and Rd,while ginsenoside Rh2 was not detected in the product.The results suggested that the glycosidases from these strains were very specific and provided a basis for the biotransformation and utilization of special target saponins .

Key words Panax notoginseng; saponin,biotransformation

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014156

第一作者:硕士研究生。

收稿日期:2017-02-26,改回日期:2017-05-12